希佩尔-林道综合征（VHLS）是一种遗传性癌症综合征，临床表现为中枢神经系统血管母细胞瘤、透明细胞肾癌、嗜铬细胞瘤、视网膜血管瘤及其他多种症状。该疾病由VHL基因突变引发粤有钱，呈常染色体显性遗传。然而部分VHLS病例为新发突变，其中极少数患者表现为嵌合型。嵌合型患者的基因检测由于血液DNA中突变等位基因的低拷贝数而容易出现假阴性结果。本文报道一例 39 岁患者通过多种方法进行VHLS分子遗传学诊断的案例，包括对非同步原发肿瘤进行突变分析、采用高覆盖深度NGS技术对血液DNA进行重复检测等。最终该患者被诊断为嵌合型VHLS，其血液DNA中c.481C>T（p.Arg161Ter）变异丰度为 2%。本文还总结了关于嵌合型VHLS的文献数据：包括临床表现的严重程度、常规VHL基因检测阴性时的鉴别诊断要点，以及突变携带者需采取的特殊主动监测与治疗方案。
背 景
希佩尔-林道综合征（VHLS）是一种遗传性癌症综合征。其临床表现为透明细胞肾癌（CCRC）及中枢神经系统血管母细胞瘤（最常见表现）；约三分之一的患者会发展为嗜铬细胞瘤。视网膜血管瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、附睾及子宫阔韧带囊腺瘤、内淋巴囊肿瘤在VHLS中较少见。非肿瘤性临床表现包括肾囊肿和胰腺囊肿。VHLS由位于3p的VHL肿瘤抑制基因的胚系突变引起，根据Knudson二次打击模型，该基因在肿瘤中失活：一个等位基因携带胚系“功能丧失”突变，而另一个等位基因在肿瘤细胞中因体细胞点突变、大片段缺失（“杂合性缺失”）或启动子甲基化发生改变。该综合征以常染色体显性方式遗传，具有高外显率。既往文献报道的VHLS新生儿发病率范围为 1:27,000-91,000，典型估计值约为 1:36,000；然而，2023 年 11 月基于gnomAD v2.1.1数据库计算的高加索人群中致病性变异携带者的频率为 1:4.4-8.9,000 例，表明过去对VHLS发病率存在低估。根据流行病学估计，VHLS可能占CCRC病例的 5%，尤其在年轻患者中。CCRC的平均发病年龄为 40-45 岁，VHLS患者终生患病风险约为 70%。符合VHLS诊断标准的患者需进行分子遗传学检测。首先通过多基因panel进行下一代测序（NGS）或Sanger测序分析VHL基因编码区及经典剪接位点的点突变。若结果为阴性，第二步需采用如MLPA（多重连接依赖性探针扩增）技术检测VHL基因区域的大片段缺失。分子遗传学检测的临床样本为全血。VHLS患者通常携带一个突变等位基因和一个正常等位基因；某些低活性VHL等位基因的复合杂合或纯合患者会出现与VHLS表型无关的遗传性红细胞增多症。
展开剩余87%然而，这一推荐诊断流程对嵌合型变异的检测灵敏度较低。例如，已报道一例 55 岁男性病例，其因左肾原发CCRC伴肺转移及右肾上腺嗜铬细胞瘤入院。检查还发现肝、骨转移及脊髓内两处血管母细胞瘤。通过包含VHL在内的NGS panel检测对患者血液DNA进行点突变及拷贝数变异（CNV）分析，未发现致病性、可能致病性或临床意义未明变异（VUS）。但对其原发肿瘤及转移灶进行DNA测序显示，所有样本均携带VHL基因3好外显子的可能致病性错义突变c.593T>C（p.Leu198Pro），突变丰度为 10-55%，这在来自不同器官、不同类型原发肿瘤的体细胞突变中极为罕见。重新分析胚系NGS数据发现，该变异在血液中突变丰度为 6%，但由于NGS数据处理时将最小等位基因频率（MAF）阈值设为 10%（胚系变异筛查中过滤测序错误[sequencing artifacts]的常规操作），该变异被过滤。肿瘤中携带VHL突变的细胞比例高于血液，且存在第二个VHL等位基因的缺失，因此所有检测样本均检出该突变。本文案例表明，若标准诊断流程未能明确符合VHLS临床标准的患者的病因，不应终止突变筛查。本文报道一例血管母细胞瘤合并CCRC的嵌合型VHLS患者。其通过Sanger测序及MLPA两次分子遗传学检测均呈阴性，导致无法推荐靶向治疗。肿瘤分析发现重复出现的致病变异，采用高覆盖深度NGS检测显示血液中突变丰度仅为 2%，最终通过实验室方法确诊VHLS。
患者详情
患者男，39 岁，2024 年因希佩尔-林道综合征（VHLS）相关问题至俄罗斯医学遗传学研究中心接受遗传咨询及分子遗传学诊断。患者无肿瘤家族史。12 岁时首次发现血管母细胞瘤并行左眼球摘除术及假体植入术。2010 年对第 4 颈椎（3.3 cm³）及第 9 胸椎（2.8 cm³）区域血管母细胞瘤行立体定向大分割放射治疗。2010 年第三方实验室采用Sanger测序及MLPA技术进行分子遗传学分析，未检出VHL突变。2013 年行延髓及小脑基底部血管母细胞瘤放射外科治疗，并行C7-Th1节段肿瘤立体定向治疗；2014-2015年切除小脑血管母细胞瘤及C3-4节段病灶。2017年对6个小脑小型血管母细胞瘤（0.03-0.6 cm³）行放射外科治疗，2018 年处理Th7及Th11节段肿瘤。2017 年因右肾 4×2.5×2.7 cm肾透明细胞癌行右肾部分切除术。2020 年起出现新发颅内病灶，颈椎肿瘤进展（胸椎及腰骶椎血管母细胞瘤无明显变化）。2021 年采用射波刀对左小脑半球 5 个血管母细胞瘤行放射外科治疗，后处理C5-Th1节段病灶。2022 年出现下肢进行性无力及严重疼痛综合征，影像学发现Th9节段髓内血管母细胞瘤伴脊髓出血，遂在神经电生理监测下行显微手术切除（病理报告：脊髓血管母细胞瘤，1 级），术后接受康复治疗。2024 年初以来，患者中枢神经系统血管母细胞瘤出现进展性改变，拟考虑系统性靶向治疗。
研究结果
常规检测未发现VHL基因变异
本文患者完全符合VHLS诊断标准：12 岁起即出现多发性中枢神经系统血管母细胞瘤，曾接受视网膜肿瘤切除术，并于 32 岁时行透明细胞肾癌（CCRC）切除术。然而，此前在另一实验室进行的首次血液VHL突变分子遗传学检测未发现基因异常。考虑到该测序及变异注释为 14 年前完成，且原实验室使用的是自行设计的MLPA探针，研究人员重新开展了VHL胚系突变筛查。通过Sanger测序分析VHL编码区及邻近剪接位点，并采用MRC Holland探针的MLPA技术筛查大片段缺失，结果仍未能从患者血液DNA中检出VHL基因的致病性/可能致病性变异或临床意义未明变异（VUS）。
肿瘤样本的VHL突变分析粤有钱
诊断第二步是对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本进行突变筛查。研究人员获得两份样本：2017 年CCRC组织及 2024 年血管母细胞瘤组织。通过Sanger测序，在两个肿瘤组织DNA中均检测到VHL基因3号外显子c.481C>T（p.Arg161Ter）变异，其突变等位基因峰清晰可见，但变异/正常等位基因比例存在差异（图1）。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该置换被归类为致病性变异，且既往已在VHLS患者中报道。由于同一体系突变在间隔 7 年、不同器官来源且组织学类型各异的原发肿瘤中同时出现的可能性极低，故推测患者可能为嵌合型VHLS。然而，从理论上仍不能完全排除这些突变的体细胞起源，需通过血液DNA验证体细胞嵌合现象以确诊先天性疾病。
▲图1 患者不同原发性肿瘤中的c.481C>T (p.Arg161Ter)变异
血液样本VHL基因3号外显子高深度NGS测序
为检测嵌合型变异，研究人员使用先前经Sanger测序未检出VHL胚系突变的血液DNA样本。扩增文库并特异性合成引物用于测序包含VHL:NM_000551.4:c.481C>T位点的区域。使用NGS进行靶向测序，目标位点覆盖深度达 261,029X（图2），足以检测嵌合现象。结果显示，4868 条读长检测到T变异等位基因，正向/反向读长比例为 0.99（2,425/2,443）；该位点的其他变异等位基因（A和G）占比均低于 0.05%，其中一种变异的正向/反向读长存在 8 倍差异，可判定为测序错误（sequencing artifacts）而过滤。突变型T等位基因比例确定为 2%，这一结果从分子水平证实了该患者为嵌合型VHLS，突变丰度低。根据AMP/ASCO/CAP（美国分子病理学会/美国临床肿瘤学会/美国病理学家协会）指南，c.481C>T（p.Arg161Ter）突变的预测意义等级为IA级；鉴于该变异为疾病致病原因，对于多发/转移性肿瘤患者，FDA已批准贝组替凡（belzutifan）靶向治疗，并获得NCCN（美国国家综合癌症网络）指南推荐。需特别指出的是，研究人员已在针对该患者靶向治疗选择的多学科会诊召开前完成VHLS嵌合型的实验室确认及诊断报告，此前因缺乏VHLS分子遗传学确诊证据，贝组替凡治疗建议曾被暂缓执行。
▲图2 嵌合变异的IGV图
讨 论
嵌合型VHL综合征的识别对于及时启动监测与遗传咨询至关重要，早在 21 世纪初就已得到关注。例如，研究者曾报道两个家系：子代患者均出现血管母细胞瘤、透明细胞肾癌（CCRC）和/或胰腺囊肿，并携带VHL基因胚系突变，但采用相同方法检测父母外周血均未检出该突变。在第一个家系中，先证者母亲患有血管母细胞瘤、胰腺及肾囊肿；第二个家系中粤有钱，先证者父亲除上述三种VHLS表现外，还罹患CCRC。通过荧光原位杂交（FISH）对白细胞DNA的深入研究，在第一个家系母亲中检出VHL基因缺失；通过异常凝胶条带的Sanger测序，在第二个家系父亲中发现与子代突变一致的 3 bp VHL缺失。这一结果成功区分了遗传性VHLS与新发突变病例。研究还表明，嵌合型VHLS的临床表现严重程度不亚于经典遗传型。另有一例女性患者，11 岁和 18 岁时分别接受肾上腺嗜铬细胞瘤切除术，其父亲因VHL体系嵌合现象出现肾囊肿及附睾囊腺瘤。常规PCR及Sanger测序未能在其父亲血液中检出VHL突变，研究者采用高效液相色谱技术成功识别含突变的PCR产物。
后续研究报道了一例高丰度但首次VHL检测漏诊的病例。该患者 66 岁因双侧CCRC进展死亡，并伴多囊肾及胰腺病变。其女在 18 岁和 36 岁时接受血管母细胞瘤切除术并检出c.194C>G（p.Ser65Trp）突变，由此怀疑患者存在嵌合现象。通过PCR-RFLP技术比较凝胶电泳中突变条带与正常条带染色强度，计算其血液基因组DNA中突变等位基因占比达 19%。2000-2010 年间，研究者采用多种改良方法检测混有大量野生型等位基因的VHL突变，但缺乏统一标准。由于毛细管遗传分析仪基础设置及色谱分析软件的限制，Sanger测序对突变等位基因占比低于 10% 的异质性样本检测灵敏度不足。
随着二代测序（NGS）技术的临床应用，可检测样本中低至数个百分点的突变等位基因。既往研究显示，约 5% 具有典型VHLS症状的患者未检出VHL胚系突变，提示可能为嵌合型。基于NGS技术的研究证实，VHLS中体细胞嵌合占比达 8.5%。目前多基因NGS panel检测已成为常规检测（甚至超越Sanger测序），其策略包括：当患者不同肿瘤中检出相同突变时，对血液DNA原始测序数据重新分析；或针对目标区域进行高覆盖深度二次NGS检测——正是通过后者，本文案例成功识别出血液中突变等位基因占比 2% 的VHL嵌合型。类似案例可见于 11 岁起反复发生血管母细胞瘤的患者：两次血液VHL胚系突变筛查均阴性，最终通过多肿瘤NGS组合检测确诊嵌合型VHLS。其他NGS成功案例包括：两名患者突变等位基因占比分别为 1.7% 和 5.7%（测序深度分别为 4059× 和 8902×），临床表现为双侧CCRC和/或早发（16 岁起）中枢神经系统血管母细胞瘤等严重VHLS表型。因此，即使第三方实验室检测未发现VHL胚系突变，仍需在病历中注明"当前检查阶段不能排除嵌合型可能"（表1）。例如，一例 38 岁男性患者确诊小脑及脊髓血管母细胞瘤、CCRC及胰腺多囊病变，两次标准流程多基因NGS panel检测均未检出VHL突变，但研究者仍合理建议通过FFPE样本分析排除嵌合型。
▲表1 常规VHLS检测中由于嵌合现象导致的假阴性结果
如果患者具有VHLS的临床特征，但常规检测中的测序和MLPA未发现任何致病或可能致病的VHL变异，则可以通过以下方式继续诊断（图3）：
▲图3 含有嵌合评估的VHLS诊断算法流程
对肿瘤组织进行VHL检测，随后重新分析血液DNA测序数据或采用高覆盖深度NGS对突变位点进行二次检测，以识别嵌合型VHLS。需与具有重叠表型的其他癌症综合征进行鉴别诊断，例如：①VHLS 2C型需与多发性内分泌腺瘤病2A型（MEN2A）及遗传性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤综合征鉴别；②疑似VHLS的遗传性CCRC需与BAP1肿瘤综合征及遗传性平衡易位t(3;8)区分。通过家系共分离分析和/或功能实验验证临床意义未明变异（VUS），尤其针对潜在剪接位点突变。采用更高通量的技术（如全基因组测序/WGS），可能获得意外发现。例如：①某患者20岁起反复发生CNS血管母细胞瘤及多灶性CCRC，无VHLS家族史，胚系点突变及VHL大片段缺失检测均阴性。WGS发现其携带新发平衡易位t(1;3)(p36.3;p25)，断裂点位于VHL基因2号内含子区域，可视为等位基因失活事件，从而确诊VHLS；②另一无VHLS家族史患者，37 岁起接受视网膜血管瘤、CNS血管母细胞瘤及多灶性CCRC治疗，Sanger测序及MLPA均未检出VHL胚系突变。家系WGS三重测序显示该患者携带ELOC基因新发胚系杂合变异c.236A>G（p.Tyr79Cys）。ELOC编码延伸蛋白C（elongin C）——pVHL在缺氧诱导因子（HIF）降解复合体中的主要结合伴侣。作者进一步证明，该变异在功能层面导致与VHL失活突变类似的后果。值得注意的是，根据2022年WHO肾肿瘤新分类，相同体系变异是界定“ELOC突变相关型肾癌”的最常见突变。这提示ELOC可能成为VHLS的第二候选基因。
比较Sanger测序与NGS检测嵌合型变异的灵敏度较为复杂，因其受多种因素影响。Sanger测序结果受以下因素制约：毛细管测序仪程序对截断线的基础设置、标记片段的信号强度、因双脱氧终止子未有效清除或非特异性PCR产物产生的次要信号噪音，以及实验室遗传学家分析色谱图的经验。而NGS检测灵敏度则取决于目标突变位点的测序深度、最小等位基因频率（MAF）、实验室分析流程，以及患者表型数据对变异注释的支持程度。总体而言，VHL等位基因中嵌合型变异比例低于 10% 时，更易出现假阴性结果。其他遗传性癌症综合征的嵌合型病例同样显示，0-10% 的突变丰度属于临界范围，需通过高深度NGS/数字PCR进行验证。例如，一例结直肠癌及子宫内膜样癌合并嵌合型林奇综合征患者，其正常结肠组织中MSH6致病性突变丰度为 5.34%，血液DNA中仅 1.64%。结节性硬化症患者研究亦表明，传统方法检测血液样本中变异等位频率的临界值为 10%，此类低水平嵌合患者的平均突变等位基因比例为 6.8%。
明确VHLS诊断对制定手术策略至关重要。与散发性CCRC（确诊后即切除）不同，VHLS患者因常发生双侧和/或多灶性CCRC，需尽可能保留功能性肾实质。因此采用"3 cm原则"：当肿瘤最大径达 2.5-3 cm且未侵犯肾包膜、肾盏/肾盂或大血管时，行小范围切除术。
识别VHLS嵌合型病例的另一重要意义在于可使用贝组替凡（belzutifan）——一种选择性HIF2α抑制剂进行治疗。细胞内HIF浓度升高是功能性pVHL缺失的后果，也是VHLS相关肿瘤发生的主要致病机制。贝组替凡是FDA批准用于确诊VHLS患者中无需即刻手术的CCRC、血管母细胞瘤及胰腺神经内分泌肿瘤的全身治疗药物。对于某些病例（如多发性进展性血管母细胞瘤患者），该药物可能是唯一合理的靶向治疗方案，因其他激酶抑制剂疗效有限。结合突变类型及其在个体患者中的预期功能效应，计算机药物设计及人工智能工具（如AlphaFold）有望为未来VHLS的个体化靶向治疗提供预测与开发支持。
经分子遗传学方法确诊的VHLS，可使患者按照专业医学协会推荐的主动监测方案进行早期肿瘤筛查。根据2017年指南，首次专项检查建议始于婴幼儿期。目前普遍采用2020年VHL联盟制定的监测方案，其年度检查项目包括：①1岁起：全身查体及散瞳眼底检查（视网膜血管瘤）；②2 岁起：血压及脉搏监测；③5 岁起：增加间甲肾上腺素类物质检测（嗜铬细胞瘤）；④11 岁起：每2年一次增强/平扫脑部和脊柱MRI、听力测试（血管母细胞瘤）；⑤15 岁起：每 2 年一次内耳道MRI（单次）、腹部MRI（透明细胞肾癌、嗜铬细胞瘤、肾/胰腺病变）。65 岁后终止部分专项监测。若发现血管母细胞瘤体积增大或伴随症状，应每年（或更频繁）进行影像学检查，必要时转诊神经外科。对于 <3 cm的肾肿瘤，每 3-6 个月行MRI复查以评估稳定性；连续三次稳定后可延长至每 2 年一次。若肾肿瘤 >3 cm，建议转诊至熟悉VHLS管理的泌尿外科。
最新指南对筛查起始年龄略有调整：2022 年丹麦研究团队建议 10 岁起启动CNS MRI筛查血管母细胞瘤；2024 年德国研究则提出 12 岁开始CNS MRI更具合理性。这些数据凸显了VHL突变鉴定对制定个体化监测策略、治疗选择及手术决策的重要指导意义。
结 论
研究人员表示需要强调以下几点：①既往可能低估VHLS及其嵌合型的发病率；②嵌合型与VHL突变“经典”杂合子的临床表现严重程度及发病年龄无显著差异；③及时诊断VHLS（包括嵌合型）对突变携带者监测、手术策略制定及贝组替凡靶向治疗至关重要；④通过血液DNA分析（尤其是联合患者FFPE肿瘤样本）结合NGS技术可有效识别嵌合型VHLS。综上，及时检出突变并明确诊断会直接影响VHLS患者的主动监测方案、手术选择及靶向治疗决策。
我司实体瘤全外显子检测、实体瘤1299基因检测、实体瘤272基因检测PLUS版、肾癌103基因检测和泌尿系统肿瘤85基因检测（NGS方法学）均可检测VHL基因，指导贝组替凡应用。
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参考文献：
Mikhaylenko, D.S.; Kuryakova, N.B.; Efremova, A.V.; Volodin, I.V.; Kutsev, S.I.; Zaletaev, D.V.; Strelnikov粤有钱, V.V. Mosaic Form of von Hippel–Lindau Syndrome: Case Report and Literature Review. Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 2751. https://doi.org/10.3390/ijms26062751
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